Пероксидный радикал - это химически активная форма кислорода, которая разрушает различные органические соединения. В живых клетках пероксид поражает генетический материал, клеточные мембраны и все остальное, с чем он может реагировать. В этой связи, пероксид в эффективной концентрации может убивать бактерии, бактериальные эндоспоры, грибки и грибковые споры, включая споры высших грибов. Пероксид, без сомнения, способен уничтожать микроорганизмы, привнесенные из воздуха, а также источники заражения, связанные с кожными покровами человека (считается, что чешуйки кожи постоянно падают с грибовода в окружающее пространство). Пероксид водорода, таким образом, в известной степени действует против всех воздушных источников заражения, включая споры самих грибов. Отмечу для контраста, что антибиотики действуют в основном против бактериального заражения, а фунгициды - только против грибков и плесеней.
Прелесть пероксида состоит в том, что он не убивает развитый мицелий и не мешает его росту и плодоношению. Несмотря на широкий спектр действия пероксида против известных источников заражения грибной культуры, существует достаточно широкий диапазон его концентраций, при которых пероксид не будет препятствовать росту и плодоношению грибов. Развитый мицелий, благодаря своей способности производить в больших количествах энзимы*, разрушающие пероксид, способен защитить себя от гораздо больших концентраций пероксида, чем изолированные споры, клетки или крошечные фрагменты многоклеточных организмов. Таким образом, мы можем добавить пероксид водорода к грибной культуре без ущерба для роста мицелия, но небольшие источники заражения при этом погибнут.
Такой подход дает массу преимуществ. Совершенно очевидно, что в нашем случае отпадает необходимость в дорогостоящих, тщательно подобранных приборах и оборудовании для защиты окружающей среды от заражений. За счет добавления пероксида водорода к среде с грибной культурой становится возможным успешное осуществление всех стадий грибного культивирования, от изоляции мицелия до плодоношения, в нестерильной среде и без фильтрации воздуха. Становятся ненужными специальные чистые комнаты, ХЕПА-фильтры, пре-фильтры, ламинарные боксы, ультрафиолетовые лампы, стерильные тамбуры, боксы с перчатками для стерильных работ (т.н. главбоксы) и любое другое оборудование, связанное с контролем бактериального заражения окружающей среды. Даже микропористые фильтры на пакетах или крышках банок становятся излишними. При использовании пероксида минимальный набор оборудования, необходимого для контроля над зараженьями, может быть сведен к градуированным емкостям, источнику кипящей воды и большой кастрюле для обработки паром (или скороварке, для пущей безопасности). Это ненамного больше, чем можно найти на обычной кухне. В то время, как традиционные методы культивирования грибов требуют выполнения сложных стерильных техник и безупречной чистоты исполнителя при работе с агаровыми культурами и посевным мицелием, использование пероксида позволяет достичь успеха при умеренном соблюдении требований к стерильности и минимальном внимании к личной гигиене. Более того, становится возможным осуществлять выгонку плодовых тел (даже тех видов, которые распространяют чрезвычайно большое количество спор) в том же самом здании, где содержатся агаровые культуры и выращивается посевной мицелий, причем без опасения, что споры, распространяемые плодовыми телами, вторгнутся в агаровые культуры и уничтожат их. Пероксид водорода однозначно убьет споры того же самого гриба, мицелий которого он (пероксид) защищает.
Приобретают ли микроорганизмы, вызывающие заражение, устойчивость к воздействию пероксида, как это происходит в случае с антибиотиками? И да и нет. Многие из таких микроорганизмов уже устойчивы к пероксиду, и если они образовали колонию, дальнейший ее рост будет очень интенсивным. Например, живая форма сине-зеленой плесени Aspergillus очень устойчива к пероксиду. Тем не менее, пероксид в достаточной концентрации несомненно преодолевает защитные механизмы одноклеточных организмов и отдельных спор, а также очень небольших изолированных многоклеточных организмов.
* Энзимы - это белковые макромолекулы, которые выполняют роль катализаторов в живых организмах (прим. Fungiest)
Чего пероксид не может обеспечить
Пероксид не отменяет полностью необходимость соблюдения правил стерильной работы. Повторюсь: не смотря на то, что добавленный пероксид будет уничтожать отдельные споры, грибки и бактерии, пробравшиеся в ваши грибные культуры (а именно эти микроорганизмы являются основным источником проблем с заражением), пероксид не сможет прекратить жизнедеятельность развитых многоклеточных организмов (например зеленой плесени), если размер колонии превысит некоторый размер. Пероксид также не будет слишком эффективным против значительного скопления спор плесени. По всей видимости, многоклеточные организмы и большие скопления проросших спор способны вырабатывать достаточное количество разрушающих пероксид энзимов для того, чтобы защитить себя от высоких концентраций пероксида во внешней среде. И в связи с тем, что микроскопические многоклеточные организмы и скопления спор могут находиться на ваших руках, частицах грязи и пыли, вам все равно придется соблюдать определенные меры предосторожности и держать ваши руки и любые нестерильные предметы подальше от культур на ранних сроках их развития, даже при добавлении пероксида. Несмотря на то, что можно не бояться оставлять культуры на открытом воздухе в течение непродолжительного времени для выполнения манипуляций или проверки их состояния, вам все равно придется предпринимать разумные меры против заражения. Например, не стоит более использовать крышку от чашки петри, если она упала на пол. Не стоит также допускать попадания на культуру какого-либо мусора или проникновения насекомых. Хорошим правилом будет периодическое вытирание пыли с полок, используемых для инкубации культур. В любом случае придется стерилизовать на пламени (или как-то еще) всякий инструмент, который используется для переноса ломтиков мицелия с одной культуры на другую. Лично я регулярно протираю пальцы спиртом перед выполнением инокуляций субстрата или агаровых культур. Я делаю то же самое со всеми поверхностями, на которых я произвожу манипуляции с чашками петри. Это уменьшает вероятность попадания в культуру крупных частиц и способствует защите открытого мицелия.
Очень важно знать и помнить, что пероксид не защищает сам грибной мицелий от аэробных контаминантов. Мицелий разлагает пероксид, с которым он контактирует, поэтому любые аэробные контаминанты, находящиеся по соседству с мицелием, будут ограждены от губительного воздействия пероксида. Таким образом, в общем случае, пероксид лишь защищает питательную среду или субстрат от аэробного заражения. Необходимость самой аккуратной работы остается актуальной для процесса переноса мицелия или для любой другой операции, подразумевающей нахождение мицелия в нефильтрованной атмосфере. Поэтому, если заражение мицелия все-таки произошло, вам придется начать все заново с чистой, незараженной культуры или каким-либо образом очистить мицелий от контаминантов. Мы рассмотрим этот вопрос позже.
Напоследок отмечу, что пероксид не является стерилизующим агентом, за исключением столь высоких концентраций, когда его использование уже не совместимо с ростом грибов. Таким образом, вы, в общем случае, не можете использовать пероксид, как таковой, для стерилизации питательной среды или субстратов. В концентрациях же, совместимых с ростом грибов, пероксид водорода не будет уничтожать живые формы плесеневых контаминантов, находящихся в среде и подвергнется быстрому разложению под воздействием энзимов, содержащихся в нестерильных органических материалах. Хотя некоторые споры бактерий и будут убиты пероксидом после его добавления в нестерильную среду, гораздо большее число контаминатнов без труда выживет и через непродолжительное время начнет свой рост. В этой связи следует запомнить: материалы среды и контейнеры должны быть пастеризованы перед добавлением пероксида или заполнением пероксидсодержащими средами; питательные среды, которые содержат сырые, не подвергавшиеся обработке органические вещества, должны быть стерилизованы под давлением для того, чтобы разрушить энзимы, разлагающие пероксид. И последнее: вода, не подвергнутая стерилизации под давлением, при использовании в составе среды с пероксидом должна быть чистой и не должна содержать видимых частиц. Любые частицы органической и даже неорганической природы, вносимые с водой в среду, могут содержать живые микроорганизмы и/или разлагающие пероксид катализаторы, которые не обязательно будут уничтожены во время пастеризации.
